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威斯騰生物經過10多年的發展，獲得了上百種細胞株和四十余種原代細胞培養經驗，并建立了龐大的細胞庫及原代培養資料庫。細胞平臺有資深實驗員、規范的SOP操作文件，萬級凈化細胞房，這些條件為保質保量完成每個客戶的實驗提供了保障。 同時，威斯騰生物結合多年原代及傳代細胞培養經驗，結合平臺已有的技術優勢，建立了完善的體外藥篩實驗，并引進RTCA(Real-time cellular Analysis，實時無標記細胞記錄儀），在藥篩過程中，全程實時記錄細胞真實狀況，為藥篩提供最真實精準的實驗數據。

無菌操作注意事項

細胞培養一定要保持工作區的無菌清潔，先用紫外燈和臭氧殺菌1h，然后通風30min，操作前需要換細胞間專用拖鞋，雙手帶上一次性橡膠手套并用75%乙醇消毒，穿上實驗服，戴上一次性口罩和帽子，操作時不能大聲說話，整個無菌操作都應該在酒精燈的周圍進行。

新西蘭大白兔膝關節軟骨細胞原代分離培養

操作方法

（1）取成年新西蘭大白兔，耳緣靜脈注射空氣處死后，取下兔子的雙腿，立即用75%乙醇浸泡。

（2）移入細胞房內，去除雙腿表面的皮毛及肌肉，剪取關節段，移至超菌工作臺內。

（3）PBS洗滌數次，用手術刀或彎剪將關節表面的軟骨組織取下。

（4）軟骨組織塊靜置5min，棄去上層液體及懸浮組織，將軟骨組織剪成1mm3的大小。移到離心管中加3倍體積的0.25%胰蛋白酶，置入37℃的恒溫搖床中，振蕩消化15-20min；

（5） 4℃靜置5min；棄上清，PBS洗滌，去上清。加入0.2%膠原酶II，置入37℃的恒溫搖床中，振蕩消化2H；
（6）加入生長培養基終止消化，反復吹打后依次通過200目濾網。收集濾液,1200rpm離心8min，棄上清，用DMEM完全培養基重新懸浮細胞, 放入37℃，5%CO2細胞培養箱中培養；

（7）細胞傳代后放入預置有薄骨片或蓋玻片的培養板中進行培養。細胞完全展開后即可固定做原代鑒定。

細胞形態

膝關節軟骨原代培養過程中，約24小時即可出現貼壁生長，細胞三角或多角形，生長緩慢，培養3-5天進入快速增殖期。

大鼠膝關節軟骨細胞的原代培養

操作方法

（1）取四周齡SD大鼠，頸椎脫臼法處死后立即用75%乙醇浸泡，移入超凈工作臺內，用大頭針固定大鼠四肢于工作臺面的泡沫板上。

（2）碘酒擦拭四肢，再用酒精棉球擦拭，無菌條件下用滅菌消毒后的鑷子和剪刀分離大腿腿骨，盡可能去除筋膜、肌肉和結締組織；從關節處分離出軟骨組織，將其剪成小于1mm3的組織塊，用含雙抗的PBS溶液沖洗兩遍。

（3）軟骨組織塊靜置5min，棄去上層液體及懸浮組織，往離心管中加3倍體積的0.25%胰蛋白酶，置入37℃的恒溫搖床中，振蕩消化15-20min；

（4） 4℃靜置5min；棄上清，加入0.2%膠原酶II，置入37℃的恒溫搖床中，振蕩消化30～60min；
（5）加入生長培養基終止消化，反復吹打后依次通過200目濾網。收集濾液,1200rpm離心8min，棄上清，用DMEM完全培養基重新懸浮細胞, 放入37℃，5%CO2細胞培養箱中培養；

（7）放入預置有薄骨片或蓋玻片的培養板中進行培養。每3天更換培養液至第5天改為無血清培養液。免疫組化鑒定原代細胞。

細胞形態

膝關節軟骨原代培養過程中，約24小時即可出現貼壁生長，細胞三角或多角形，生長緩慢，培養3-5天進入快速增殖期。

威斯騰實驗服務流程

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