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熒光定量PCR（也稱TaqMan PCR,以下簡稱FQ-PCR）是美國PE（Perkin Elmer）公司1995年研制出來的一種新的核酸定量技術(shù)，該技術(shù)是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上加入熒光標(biāo)記探針來實現(xiàn)其定量功能的，與變通PCR相比，F(xiàn)Q-PCR具有許多優(yōu)點。與普通PCR相比，F(xiàn)Q-PCR具有許多優(yōu)點：1、封閉反應(yīng)，無需PCR后處理。2、特異性強(qiáng)，靈敏度高。3、采用對數(shù)期分析，摒棄終點數(shù)據(jù)，定量準(zhǔn)確。4、定量范圍寬，可達(dá)到10個數(shù)量級。5、儀器在線式實時檢測，結(jié)果直觀，避免人為判斷。6、可實現(xiàn)一管雙檢或多檢。7、操作安全，縮短時間，提高效率。熒光定量 PCR是 通過對 PCR 擴(kuò)增反應(yīng)中每一個循環(huán)產(chǎn)物熒光信號的實時檢測從而實現(xiàn)對起始模板定量及定性的分析。

熒光定量PCR分類：
☆TaqMan熒光探針
PCR擴(kuò)增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個報告熒光基團(tuán)和一個淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時，報告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號被淬滅基團(tuán)吸收；PCR擴(kuò)增時，Taq酶的5‘-3‘外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。
☆SYBR Green熒光染料
SYBR Green是一種DNA結(jié)合染料，能非特異地?fù)饺氲诫p鏈DNA中去。在游離狀態(tài)下，它不發(fā)出熒光，但一旦結(jié)合到雙鏈DNA中以后，便可以發(fā)出熒光。它的最大優(yōu)點就是可以與任意引物、模板相配合，用于任意反應(yīng)體系中。從經(jīng)濟(jì)角度考慮，它也比其它的探針的價格要便宜得多。但由于它能與所有的雙鏈DNA結(jié)合，所以一旦反應(yīng)體系中出現(xiàn)非特異擴(kuò)增，那它就會影響到定量結(jié)果的可靠性與重復(fù)性。要避免這種不利因素，可以通過選擇良好的引物并優(yōu)化反應(yīng)條件以消除非特異性影響。

●主要實驗步驟如下：

RT-qPCR是由三個步驟組成:
1.反轉(zhuǎn)錄:依賴反轉(zhuǎn)錄酶將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNDA;
2.擴(kuò)增:用PCR的方法擴(kuò)增cDNA;
3.檢測:實時檢測和定量擴(kuò)增的產(chǎn)物.

具體實驗操作步驟：

1.設(shè)計并合成Realtime PCR引物。
2.引物溶解后使用Promega的TaqDNA聚合酶進(jìn)行含SG（SYBR?； Green）的PCR反應(yīng)的優(yōu)化。
3.客戶樣品RNA抽提
實驗對象為組織樣品，取適量（50-100mg）新鮮組織樣品或正確保存的組織樣品加1ml的RNA抽提試劑Trizol（Invitrogen），勻漿后抽提RNA。
實驗對象為細(xì)胞樣品，每份樣品取1×106～1×107細(xì)胞，PBS清洗細(xì)胞，去PBS加1ml的RNA抽提試劑Trizol（Invitrogen），裂解后抽提RNA 。
4.RNA質(zhì)量檢測
a.紫外吸收測定法測定RNA在分光光度計260nm和280nm處的吸收值，以計算其濃度并評估RNA純度 。
b.使用ambion公司的甲醛電泳試劑進(jìn)行變性瓊脂糖凝膠電泳，檢測RNA純度及完整性。
5.使用逆轉(zhuǎn)錄酶（Promega）進(jìn)行反應(yīng)，將樣品RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。
6.制備標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品：
進(jìn)行相對定量，需要先將樣品的目的基因以及管家基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其產(chǎn)物進(jìn)行梯度稀釋用于做標(biāo)準(zhǔn)曲線。
7.標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品和待測樣品分別加入到含SG的RealTime PCR反應(yīng)液中，進(jìn)行RealTime PCR擴(kuò)增和檢測。
8.檢測結(jié)果進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線分析：以對待測樣品的目的基因進(jìn)行定量。相對定量實驗需要進(jìn)一步用樣品的目的基因測得值除以管家基因測得值以校正誤差，所得結(jié)果代表某樣品的目的基因相對含量。
9.提供實驗報告：包括詳細(xì)的實驗方法及實時熒光定量PCR實驗結(jié)果的相關(guān)圖表 。

熒光定量PCR中的一些術(shù)語

1.CT值：熒光信號有統(tǒng)計意義顯著增長(即穿過閾值線)時的循環(huán)次數(shù)，或者說是從基線到指數(shù)增長的拐點所對應(yīng)的循環(huán)次數(shù)。

2.閾值：閾值的默認(rèn)設(shè)置是3-15個循環(huán)的熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。

3.CT值與起始模板的量成線性關(guān)系。

客戶須知：

1、請您提供新鮮的且盡量多的材料，或直接提供純化好的總RNA或DNA（大于5ug/樣本）。如是如織：100－200mg

2、請通過EMAIL提供已知的全長基因序列。

3、請?zhí)峁┰敿?xì)背景資料：DNA/RNA來源，豐度。

結(jié)果提供：

1、實驗詳細(xì)步驟，和相關(guān)數(shù)據(jù)。

2、標(biāo)準(zhǔn)曲線，擴(kuò)增曲線，溶解曲線。

3、完整的實驗報告（含軟件分析結(jié)果）

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