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威斯騰生物經(jīng)過10多年的發(fā)展，獲得了上百種細(xì)胞株和四十余種原代細(xì)胞培養(yǎng)經(jīng)驗，并建立了龐大的細(xì)胞庫及原代培養(yǎng)資料庫。細(xì)胞平臺有資深實驗員、規(guī)范的SOP操作文件，萬級凈化細(xì)胞房，這些條件為保質(zhì)保量完成每個客戶的實驗提供了保障。 同時，威斯騰生物結(jié)合多年原代及傳代細(xì)胞培養(yǎng)經(jīng)驗，結(jié)合平臺已有的技術(shù)優(yōu)勢，建立了完善的體外藥篩實驗，并引進(jìn)RTCA(Real-time cellular Analysis，實時無標(biāo)記細(xì)胞記錄儀），在藥篩過程中，全程實時記錄細(xì)胞真實狀況，為藥篩提供最真實精準(zhǔn)的實驗數(shù)據(jù)。

無菌操作注意事項

細(xì)胞培養(yǎng)一定要保持工作區(qū)的無菌清潔，先用紫外燈和臭氧殺菌1h，然后通風(fēng)30min，操作前需要換細(xì)胞間專用拖鞋，雙手帶上一次性橡膠手套并用75%乙醇消毒，穿上實驗服，戴上一次性口罩和帽子，操作時不能大聲說話，整個無菌操作都應(yīng)該在酒精燈的周圍進(jìn)行。

小鼠巨噬細(xì)胞的原代分離培養(yǎng)

培養(yǎng)板的包被

（1）將蓋玻片裁成 0.5cm×0.5cm 大小，洗滌劑浸洗、烘干。

（2）經(jīng) 5%鹽酸浸泡30min，自來水沖洗20min，三蒸水沖洗，浸泡過夜并烘干；移入 95%酒精浸泡保存。用前酒精燈烤干，放入 24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板。

（3）用 0.01%的 L-多聚賴氨酸溶液包被培養(yǎng)皿和小玻片，37℃恒溫孵育 4h 或常溫過夜。

吸棄 L-多聚賴氨酸溶液，滅菌去離子水漂洗培養(yǎng)孔及小玻片，晾干備用。

小鼠巨噬細(xì)胞的分離及培養(yǎng)

(1) 實驗開始前向小鼠腹腔注射0.5ml含40μg刀豆球蛋白a的磷酸鹽緩沖液（PBS）。

(2) 3天后，斷頸處死小鼠，75%酒精消毒小鼠皮膚。

(3) 置動物于解剖臺上，用針頭固定四肢，雙手持鑷撕開皮膚拉向兩側(cè)，暴露出腹膜，但勿傷及腹膜壁。

(4) 再用70％酒精擦洗腹膜壁后，用注射器吸10ml 無菌PBS液注入腹腔中，同時從兩側(cè)用手指揉壓腹膜壁，令液體在腹腔內(nèi)充分流動。

(5) 用針頭輕輕挑起腹壁，使動物體微傾向一側(cè)，使腹腔中液體集于針頭下吸取入針管內(nèi)。

(6) 小心拔出針頭，把液體注入離心管中，1000r/min 4℃離心10分鐘，棄去上清液，重復(fù)兩次，加入完全培養(yǎng)液重懸。

(7) 將濾液進(jìn)行臺盼藍(lán)拒染試驗,血細(xì)胞計數(shù)板鏡下計數(shù)。以 8.0 ×104至 1.0 ×105/mL的密度將細(xì)胞以 400μl/孔接種到預(yù)先用L-多聚賴氨酸包被的24 孔培養(yǎng)板或 100μl/孔接種 96 孔培養(yǎng)板。

(8) 用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)24-48 h直到融合。

小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞的原代分離培養(yǎng)

培養(yǎng)板的包被

（1）將蓋玻片裁成 0.5cm×0.5cm 大小，浸洗、烘干。

（2）經(jīng) 5%鹽酸浸泡30min，自來水沖洗20min，三蒸水沖洗，浸泡過夜并烘干；移入 95%酒精浸泡保存。用前酒精燈烤干，放入 24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板。

（3）用 0.01%的 L-多聚賴氨酸溶液包被培養(yǎng)皿和小玻片，37℃恒溫孵育 4h 或常溫過夜。

去除 L-多聚賴氨酸溶液，滅菌去離子水漂洗培養(yǎng)孔及小玻片，晾干備用。

小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞的混合培養(yǎng)

(1) 75%（體積分?jǐn)?shù)）酒精消毒新生 24h 內(nèi)的清潔級小鼠，在無菌條件下斷頭，剪開頭皮及顱骨，取出腦組織，置于盛冷的pH7.2,無鈣、鎂的D-Hank's液的平皿中（下置冰袋）。

(2) 無菌剝離腦組織，除去小腦、海馬、大腦髓質(zhì),分離大腦皮層，仔細(xì)剝離腦膜及血管。

(3) 用虹膜剪將組織剪切成 1mm3左右的組織塊，0.125%胰蛋白酶消化，37℃作用 20min，期間振搖 2～3 次。

（4）棄去上清液，加入完全接種液終止消化，漂洗兩次。巴斯德吸管輕輕吹打至肉眼觀察無明顯的腦組織團(tuán)塊，靜置 2min。

（5）懸液收集于新的離心管，離心（1000r/min，10 min，4℃），棄去上清液。加入完全培養(yǎng)液重懸，200 目不銹鋼網(wǎng)過濾。根據(jù)實驗需要接種于若干個25cm細(xì)胞培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿中。

（6）置 37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h后更換一次培養(yǎng)基，以后每3d換一次液，并在鏡下觀察細(xì)胞的生長和存活情況。

小膠質(zhì)細(xì)胞的分離和純化

（1）細(xì)胞培養(yǎng)14～16d左右,在倒置相差顯微鏡下可觀察到混和膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物中出現(xiàn)細(xì)胞分層現(xiàn)象, 即底層為扁平、多種形狀的、具有多個突起的星型膠質(zhì)細(xì)胞,小膠質(zhì)細(xì)胞明顯偏小呈類圓形、折光性強(qiáng),附著于星型膠質(zhì)細(xì)胞表面生長。

2）倒掉培養(yǎng)液,用0.05%胰酶2～3mL消化,邊觀察邊輕輕晃動培養(yǎng)瓶,等到貼附在星形膠質(zhì)細(xì)胞上的小膠質(zhì)細(xì)胞脫離下來,將含漂浮的小膠質(zhì)細(xì)胞的消化液轉(zhuǎn)入10mL離心管，立刻用完全培養(yǎng)基終止消化。

（3）離心管配平,1000r/min, 離心5min, 棄上清；加定量完全培養(yǎng)再次吹打成細(xì)胞懸液,接種于預(yù)先包被的置有蓋玻片的24孔培養(yǎng)板,置于CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱(37度)培養(yǎng)。

（4）生長24h后吸掉培養(yǎng)液,以去除未貼壁的少突膠質(zhì)細(xì)胞,加完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

大鼠肝細(xì)胞原代分離培養(yǎng)

（1）麻醉及灌流：將大鼠以7%水合氯醛（0.5ml/100g）麻醉，75%乙醇消毒后移至工作臺，0.45mm頭皮針連接蠕動泵，打開蠕動泵，調(diào)整蠕動泵灌流速度為7ml/min，抽取37℃預(yù)熱的灌流液I并排空裝置內(nèi)的空氣。打開腹腔，將胃腸結(jié)構(gòu)推向左腹上側(cè)，分離出下腔靜脈（腎上段）、肝門靜脈，剪開隔膜，動脈夾夾閉下腔靜脈肝上段，將頭皮針插入下腔靜脈（腎上段），動脈夾夾閉固定，打開蠕動泵，灌注37℃預(yù)熱的灌流液I，確定肝臟均勻膨脹后剪開肝門靜脈，繼續(xù)灌流至肝臟變成土黃色且肝門靜脈剪斷處流出無色灌流液為止，更換預(yù)先預(yù)熱的37℃灌流液II，直至肝臟表面出現(xiàn)白色裂紋時停止灌流。剪下肝臟，置于無菌D-Hanks溶液中。

（2）肝細(xì)胞的收集：將肝臟在PBS溶液中洗2次，然后放入高糖DMEM培養(yǎng)基中，眼科鑷撕開肝包膜，此時肝細(xì)胞會分散在培養(yǎng)基中，然后用200目不銹鋼細(xì)胞篩過濾，將濾液轉(zhuǎn)移至15ml無菌離心管。

（3）肝細(xì)胞純化：將收集的濾液以800rpm離心5min，棄去上清，用高糖DMEM完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，用200目不銹鋼細(xì)胞篩再次過濾，離心收集細(xì)胞沉淀。用高糖DMEM肝細(xì)胞生長培養(yǎng)液重懸細(xì)胞。
（4）肝細(xì)胞計數(shù)及活力檢測：取0.1ml肝細(xì)胞懸液與0.1ml PBS、0.1 ml40g/l的臺盼藍(lán)儲備液混合后，用血細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)收獲的肝細(xì)胞總量及存活率。
（5）將肝細(xì)胞懸液調(diào)整細(xì)胞5x105/ml接種于鋪有鼠尾膠原的培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24h后換液，用高糖DMEM肝細(xì)胞生長培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。后續(xù)隔天換液培養(yǎng)。

威斯騰生物服務(wù)流程

威斯騰生物服務(wù)項目

細(xì)胞生物學(xué)檢測	高通量測序	代謝組學(xué)
細(xì)胞原代培養(yǎng)	mRNA測序	氣相色譜GC/MS
MTT檢測	LncRNA測序	液相色譜LC/MS
細(xì)胞凋亡檢測	全基因組測序	核磁共震NMR
細(xì)胞周期檢測	RNA-Seq測序
細(xì)胞克隆形成實驗	外顯子測序	影像學(xué)相關(guān)實驗
Transwell細(xì)胞遷移/侵襲	16s擴(kuò)增子測序	Micro-CT
流式分選	Small RNA測序	小動物活體成像
CCK8/XTT檢測	宏基因組測序	核磁共振
臺盼藍(lán)檢測細(xì)胞活性	單細(xì)胞測序	PET-CT
藥物篩選細(xì)胞學(xué)實驗	circleRNA測序
細(xì)胞粘附性檢測	甲基化測序	基因編輯動物
細(xì)胞劃痕實驗		條件性敲除小鼠/大鼠
細(xì)胞生物學(xué)整體實驗		全基因敲除小鼠/大鼠
細(xì)胞成管實驗
病理檢測	CRISPR/Cas9細(xì)胞敲除/敲入	基因芯片
掃描電鏡	基因定點突變細(xì)胞系	LncRNA芯片
透射電鏡	單基因敲除細(xì)胞系	miRNA芯片
HE染色	多基因敲除細(xì)胞系	mRNA芯片
免疫組化	目的基因敲入細(xì)胞系	甲基化芯片（限人和小鼠來源樣本）
Tunel（原位末端凋亡法）檢測	報告基因敲入細(xì)胞系	SNP芯片（限人和小鼠來源樣本）
激光共聚焦	miRNA/LncRNA敲除細(xì)胞系
免疫熒光
Masson染色	CRISPR/Cas9動物敲除/敲入
原位雜交	基因敲除大鼠/小鼠
熒光原位雜交	基因敲入大鼠/小鼠
特殊染色（PSA、茜素紅、阿爾新藍(lán)等）
行為學(xué)檢測	藥物篩選服務(wù)項目	藥效學(xué)評價
曠場實驗	高通量自動藥物篩選平臺	抗腫瘤藥物藥效學(xué)評價
重復(fù)性刻板行為檢測	細(xì)胞高內(nèi)涵藥物篩選平臺	心血管系統(tǒng)藥物藥效學(xué)評價
動物跑臺檢測	蛋白質(zhì)組學(xué)靶標(biāo)研發(fā)平臺	泌尿系統(tǒng)藥物藥效學(xué)評價
強(qiáng)迫游泳	分子藥理研究平臺	內(nèi)分泌系統(tǒng)藥物藥效學(xué)評價
	生物膜片鉗藥物篩選平臺	抗炎免疫藥物藥效學(xué)評價
	常規(guī)藥物體外篩選

【本平臺合作項目】
分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、基因敲出/入、模式動物、SPF動物保種、病理學(xué)檢測、免疫學(xué)檢測、影像學(xué)檢測、原代培養(yǎng)、細(xì)胞藥篩、CRISPR/Cas9基因編輯、基因芯片、高通量測序、蛋白組學(xué)、代謝組學(xué)、高通量高內(nèi)涵篩選、藥效學(xué)評價、藥理毒理學(xué)實驗、慢病毒包裝與穩(wěn)轉(zhuǎn)株建立、SiRNA與納米載藥、ChIP、CO-IP、生物信息學(xué)分析、知識產(chǎn)權(quán)服務(wù)！
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