【項目評估】

基因組信息分析

**  [ Homo sapiens (human) ]

Gene ID: **, updated on 2-Aug-2020

**基因具有3個轉錄本NR_002**.2 、NR_131**.1、NR_131**.1。需要在轉錄本的重疊位置設計靶點，進行敲除，3轉錄本具有多個重復區(qū)域，可以設計出合適靶點。

細胞株分析

細胞敲除是否成功細胞培養(yǎng)影響很大，要求細胞株可以持續(xù)傳10代以上不能分化，而且需要較好的增值能力（因為需要培養(yǎng)細胞克隆），細胞增值慢實驗周期會比較長，本實驗方案使用A375細胞株，可以達到實驗要求。

【項目報告】

1、基因組信息

Homo sapiens chromosome 11, GRCh38.p7 Primary Assembly

NCBI Reference Sequence:**

在第2-5顯子上下游分別設計靶位點（外顯子紅色字體）

     7621 gcgctgcacc catcccagaa tcccccaccc tggaaccccc atcccccttt tcatgtactc

     7681 ctccccatgc cccccagccc ccctctgccc aaggctggcc tcccccacat catgcccaca

     7741 gcccggattc cagagtcctc gagacaaatt gctgtaacag tgtttattga tgatgagtcc

     7801 agggctcctg ctgaagccct ggtggggagg ggcacagagc gagatggggc gtaatggaat

     7861 gcttgaaggc tgctccgtga tgtcggtcgg agcttccaga ctaggcgagg gcagggtgag

……

     8881 aggaaggccg gacgcgcctc ctctgtcctc gccgtcacac cggaccatgt catgtcctgc

     8941 ttgtcacgtc caccggacct ggcgtcttgg ccttcggcag ctggtgggca cgtccacccc

     9001 agctggagac ctggctgtgg ggagaacgag agagtcgtgt ggggagaacg tgttggttgt

     9061 gtggggaggg gcgggtgggg gctgagggtg gcagaggggg aaaaactcac cctcgtctcc

     9121 agcccgaacg ctgaggcacc gatcccggct ccgtcgccgc ccgcgaggcc cgccttggcc

靶點設計：

在線工具：http://crispr.mit.edu/

上游

Target-1

GACTCTGGAATCCGGGCTGT

Target-2

GGACTCTGGAATCCGGGCTG

下游

Target-3

GTCCGGTGGACGTGACAAGC

Target-4

GGCCAAGACGCCAGGTCCGG

2、構建載體px458- **-T1、px458- **-T2、 px458-**-T3和px458- **-T4

3、轉染

（1）去內毒素質粒提取（詳細步驟參見PureLink? HiPure Plasmid FP (Filter and Precipitator) Maxiprep Kit）

（2）轉染（步驟詳細參見Lipofectamine? 3000 Reagent）

（3）流式分選轉染陽性細胞

（4）細胞克隆培養(yǎng)

將轉染回收的GFP陽性細胞，采用極度稀釋的方法，將細胞放入10cm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，帶觀察到明顯的細胞克隆，將細胞細胞克隆傳代至96孔板，再繼續(xù)傳代至6孔板。

如圖：

（5）活性檢測

PCR產物凝膠瓊脂糖電泳檢測顯示，第6和第8細胞克隆靶位點區(qū)域條片段缺失較大，將6與8細胞克隆測序進一步檢測靶點突變情況。

4、測序鑒定

PCR擴增**靶位點序列，測序篩選，最終篩選得到**基因大片段敲除的細胞克隆。